体积排阻色谱柱：原理、应用及与其他色谱柱的比较！
体积排阻色谱柱(Size Exclusion Chromatography Column，简称 SEC 柱)是液相色谱中一种基于分子尺寸(体积)差异实现分离的特殊色谱柱，广泛应用于生物化学、高分子材料、药物分析等领域。以下从基本定义、分离原理、核心应用场景三方面展开介绍：
一、体积排阻色谱柱的定义
体积排阻色谱柱内部填充有多孔性凝胶填料(如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺或硅胶基质微球)，其分离机制不依赖分子的电荷、极性或疏水性，而是完全基于分子的尺寸( hydrodynamic volume)和形状。
关键特点：
填料孔径大小决定分离范围(如小分子可进入小孔，大分子被排阻)。
分离过程温和，适合不耐高温、易变性的生物大分子(如蛋白质、核酸、多糖等)。
二、分离原理：分子筛效应(Molecular Sieving)
1、核心机制
流动相携带样品进入色谱柱，分子根据尺寸差异扩散到填料孔隙中：
大分子：无法进入填料微孔，只能沿填料颗粒间的空隙流动，路径短，保留时间短，先流出。
小分子：可进入填料微孔内部，流动路径长，保留时间长，后流出。
分离结果：分子按尺寸从大到小依次洗脱，实现分级分离。
填料颗粒结构：〇〇〇(多孔网络)
大分子 → 直接通过颗粒间隙 → 快速流出
小分子 → 进入孔隙内部 → 缓慢流出
2、影响分离的关键参数
填料孔径：决定可分离的分子量范围(如孔径小的柱子适合分离低分子量物质)。
柱长与流速：柱长增加可提高分离度，流速过快可能降低分离效果。
流动相组成：需维持样品溶解性和稳定性(如缓冲液 pH、离子强度等)。
三、应用场景
体积排阻色谱柱因其温和性和尺寸选择性，在以下领域发挥关键作用：
1. 生物大分子分析
蛋白质与多肽：
分离蛋白质单体、多聚体(如抗体药物的聚集体检测)。
测定蛋白质分子量分布(需结合标准品校正)。
监测蛋白降解或变性(如温度、pH 对蛋白结构的影响)。
核酸：
分离 DNA/RNA 的不同构型(如超螺旋 DNA 与线性 DNA)。
评估核酸完整性(如降解产物与完整链的区分)。
多糖与疫苗：
分析疫苗中多糖的分子量均一性(如肺炎疫苗多糖纯度检测)。
分离病毒样颗粒(VLPs)或病毒载体的完整性。
2. 高分子材料研究
聚合物分子量分布：测定合成高分子(如聚乙烯、聚丙烯酸)的分子量及其分布(GPC，凝胶渗透色谱，属于体积排阻色谱的一种)。
聚合物纯度与降解：检测聚合物中的低聚物、杂质或降解产物。
3. 药物研发与质量控制
生物药分析：
ADC 药物(抗体 – 药物偶联物)中游离药物与偶联物的分离。
宿主细胞蛋白(HCP)与目标蛋白的快速分离(如细胞培养液纯化监控)。
小分子药物辅助分析：分离药物中的高分子杂质(如蛋白类污染物)。
4. 其他领域
食品与农业：检测食品中多糖(如果胶、淀粉)的分子量，评估品质。
环境科学：分离环境样品中的高分子污染物(如腐殖酸)。
体积排阻色谱柱是利用 “分子筛” 原理实现分子尺寸分离的工具，具有温和、高效、无样品损失的特点，尤其适合生物大分子的分析与纯化。随着生命科学与材料科学的发展，其在药物研发、质量控制、基础科研中的应用将更加广泛。如需选择具体型号(如恒谱生 Bio-SEC 柱)，需根据目标分子尺寸、检测需求(如灵敏度、载样量)及仪器兼容性综合考量。
四、体积排阻色谱柱与其他色谱柱的比较
1、分离机制：核心差异
| 色谱类型 | 分离机制 | 关键影响因素 |
| 体积排阻色谱柱（SEC） | 基于分子尺寸（ hydrodynamic volume）差异，利用填料孔隙的 “分子筛效应” 分离： - 大分子无法进入孔隙，先流出； - 小分子进入孔隙，后流出。 |
填料孔径大小、分子体积 / 形状 |
| 反相色谱柱（RP-HPLC） | 基于分子疏水性差异： ‘- 疏水性强的分子与固定相（如 C18）作用强，保留时间长； ‘- 极性分子先流出。 |
固定相疏水性（C18/C8 等）、流动相极性（如乙腈 / 水比例） |
| 离子交换色谱柱（IEC） | 基于分子电荷差异： ‘- 带电荷分子与固定相（如磺酸基 / 季铵基）发生静电吸附，电荷密度高的分子保留时间长。 |
固定相电荷基团类型（阳离子 / 阴离子交换）、流动相 pH 和离子强度 |
| 亲和色谱柱（AC） | 基于生物分子特异性相互作用（如抗体 – 抗原、酶 – 底物）： ‘- 目标分子与固定相配体特异性结合，其他分子先流出，通过改变条件洗脱目标分子 |
配体类型（如 Protein A、肝素）、洗脱条件（pH、竞争性分子） |
| 正相色谱柱（NP-HPLC） | 基于分子极性差异： ‘- 极性分子与固定相（如硅胶、氨基柱）作用强，保留时间长； ‘- 非极性分子先流出。 |
固定相极性（硅胶 / 氰基柱等）、流动相极性（如正己烷 / 异丙醇比例） |
2、填料特性：决定分离机制的基础
| 色谱类型 | 填料材质与结构 | 孔径与表面性质 |
| 体积排阻色谱柱（SEC） | 多孔凝胶填料（如硅胶基质微球、葡聚糖、琼脂糖），孔径分布均匀，表面惰性（减少非特异性吸附）。 | 孔径大小决定分离范围（如小孔径分离低分子量，大孔径分离蛋白质等大分子）。 |
| 反相色谱柱（RP-HPLC） | 硅胶基质键合疏水性基团（如 C18、C8、苯基），表面疏水。 | 孔径通常较小（6-12 nm），适合小分子（<2000 Da）。 |
| 离子交换色谱柱（IEC） | 硅胶或聚合物基质键合离子基团： | 孔径适中（8-10 nm），表面带电荷，需控制流动相 pH 使目标分子带电。 |
| - 阳离子交换（如磺酸基 – SO₃⁻）； | ||
| - 阴离子交换（如季铵基 – NR₃⁺）。 | ||
| 亲和色谱柱（AC） | 基质（如琼脂糖、硅胶）偶联特异性配体（如 Protein A、镍离子、肝素）。 | 大孔径（如琼脂糖凝胶孔径可达数百 nm），便于大分子扩散结合配体。 |
| 正相色谱柱（NP-HPLC） | 极性固定相（如未键合硅胶、氨基柱、氰基柱），表面富含羟基或极性基团。 | 孔径较小，依赖表面极性基团与分子相互作用。 |
3、应用场景：因机制而异
| 色谱类型 | 典型应用 | 适合的样品类型 |
| 体积排阻色谱柱（SEC） | - 生物大分子分离：蛋白质聚集体、核酸构型、病毒颗粒完整性分析； | 大分子（>1000 Da）、对剪切力 / 化学环境敏感的生物样品（如抗体、酶）。 |
| - 聚合物分子量分布测定（GPC）； | ||
| - 温和条件下的样品脱盐或缓冲液交换。 | ||
| 反相色谱柱（RP-HPLC） | - 小分子药物分析（如阿司匹林、抗生素）； | 中低分子量（<5000 Da）、具疏水性的化合物（如多肽、小分子有机物）。 |
| - 多肽测序与纯度检测； | ||
| - 环境污染物（如 PAHs）分离。 | ||
| 离子交换色谱柱（IEC） | - 蛋白质电荷异构体分离（如单抗电荷异质性分析）； | 带电生物分子（蛋白质、核酸、氨基酸），需通过 pH 调节电荷状态。 |
| - 核酸分离（如质粒 DNA 纯化）； | ||
| - 氨基酸分析。 | ||
| 亲和色谱柱（AC） | - 抗体纯化（Protein A/G 柱）； | 目标分子需具备特异性结合位点（如抗体 Fc 段、His 标签），适合纯化或互作分析。 |
| - 重组蛋白分离（His 标签 – Ni 柱）； | ||
| - 受体 – 配体相互作用研究。 | ||
| 正相色谱柱（NP-HPLC） | - 手性化合物分离； | 极性分子（如糖类、天然产物），流动相需用非极性溶剂（如正己烷）。 |
| - 极性小分子（如糖类、脂类）分析； | ||
| - 药物中间体纯度检测。 |
4、关键对比总结
| 维度 | 体积排阻色谱柱（SEC） | 反相色谱柱（RP-HPLC） | 离子交换色谱柱（IEC） | 亲和色谱柱（AC） |
| 分离核心 | 分子尺寸 / 孔径筛分 | 疏水性差异 | 电荷差异 | 特异性生物相互作用 |
| 是否破坏样品 | 否（温和分离，无化学作用） | 可能（流动相含有机溶剂，可能变性） | 否（依赖电荷，不破坏结构） | 否（特异性结合，条件温和） |
| 典型样品 | 抗体、DNA、聚合物 | 小分子药物、多肽 | 带电蛋白、核酸 | 带标签蛋白、抗体 |
| 流动相要求 | 水相缓冲液（需维持样品稳定） | 水 – 有机溶剂（如乙腈、甲醇） | 水相缓冲液（含盐调节离子强度） | 水相缓冲液（需含特异性洗脱剂） |
| 分离速度 | 较快（分子仅按尺寸扩散，无吸附过程） | 中等（依赖疏水性相互作用动力学） | 中等（依赖电荷吸附平衡） | 较慢（需特异性结合 – 洗脱动力学） |
5、如何选择色谱柱?
1. 根据样品性质：
● 大分子、易变性样品 → SEC 柱(如抗体聚集体分析)。
● 小分子、疏水性强 → 反相柱(如药物含量检测)。
● 带电分子(如蛋白电荷异质性)→ 离子交换柱。
● 需高效纯化特定生物分子 → 亲和柱(如抗体纯化)。
2. 根据分离目标：
● 按尺寸分级(如分子量分布)→ SEC;
● 按极性 / 疏水性分离 → 反相 / 正相;
● 按电荷分离 → 离子交换;
● 按特异性结合分离 → 亲和。
通过以上差异对比，可根据具体实验需求选择最适配的色谱柱类型。例如，恒谱生 Bio-SEC 体积排阻色谱柱即针对生物大分子的尺寸分离优化，通过特殊键合工艺降低非特异性吸附，适合对灵敏度、柱寿命要求高的生物分析场景(如 ADC 药物偶联效率检测、疫苗蛋白聚集状态分析等)。
发布于: 2025-05-24