药物中基因毒性杂质检测分析方法的相关探究！

基因毒性杂质具有极大的危害性，为保障用药安全，必须严格把控其在药物中的含量限度。这类杂质存在种类繁多、化学性质活泼等特点，导致分析检测方法复杂多样，这对药物中基因毒性杂质检测方法的制定提出了颇高要求。下面小编从基因毒性杂质的研究思路、来源、分类、限度、检测方法及研究难点六个维度展开总结与分析，旨在为药物中基因毒性杂质的检测工作提供有益参考。​

在药品中，那些影响其纯度的物质被称作杂质。药品里的杂质通常没有治疗功效，部分还会对药物的稳定性和疗效产生不良影响，甚至可能引发不良用药事件。​

药物中杂质的来源主要有两个方面：一是在药物生产过程中引入;二是在储藏或运输过程中，因受到外界条件影响，药物的理化特性发生改变而产生。Ashby 等人在对 300 多种化合物对 DNA 活性影响的研究基础上，首次提出了基因毒性的概念。​

基因毒性杂质(genotoxic impurity，GTI)指的是 “经过适当的遗传毒性实验模型，如细菌基因突变(Ames)实验，证实具有遗传毒性的杂质”。该类杂质可能通过基因突变、染色体畸变、DNA 损伤与修复等途径，与 DNA 发生直接或间接的相互作用，进而改变 DNA 的结构与构象、造成 DNA 损伤，影响 DNA 功能或改变其遗传特性，最终可能引发突变、癌变、畸变等遗传毒性。​

有关药物中基因毒性杂质超标导致药品召回的事件屡有报道，各国药品监督管理部门纷纷出台一系列关于药物中基因毒性杂质控制的指导文件，目的就是严格控制该类杂质在药物中的限度。本文从基因毒性杂质的研究思路、来源、分类、限度、检测方法和研究难点六个方面进行剖析与总结，为该类杂质的研究提供一定的理论依据和参考。​

1、基因毒性杂质的研究思路​

要将药物中的基因毒性杂质完全去除，在实际操作中难度极大。ICH、EMA 和 FDA 都颁布了相关的基因毒性杂质控制指导文件，推荐采用毒理学关注阈值(threshold of toxicological concern，TTC，1.5 μg・d⁻¹)来控制用药风险。​

TTC 的具体含义是，在人的一生中(以 70 岁计)，每天摄入 1.5 μg 基因毒性杂质，其致癌风险处于可接受范围(<1/100000)。所以在实际检测中，基因毒性杂质采用限度检查的方法。药物中基因毒性杂质的具体研究思路如下：​

① 根据药物合成工艺中使用的起始物料、试剂和催化剂等，结合可能发生的化学反应，推测药物中可能引入的基因毒性杂质并对其进行分类。​

② 确定杂质可接受的最大限度。​

③ 开发药物中基因毒性杂质的检测方法。​

④ 建立专属性强、稳定性好、灵敏度高、分析速度快的分析方法，并进行方法学验证。​

⑤ 对供试品进行测定，确认样品中基因毒性杂质的限度是否符合要求。​

根据研究思路、待测物的性质以及各种检测手段的特点，可总结出基因毒性杂质的研究决策树。​

2、基因毒性杂质的来源​

药物中基因毒性杂质的来源包括原料药合成的起始物料、反应中间体、催化剂和试剂等。此外，在药物的合成、制剂生产、储存或运输过程中也可能生成基因毒性杂质。由此可见，药物中基因毒性杂质的来源贯穿于药品的生产和流通全过程。​

本文将药物中基因毒性杂质的来源分为三类：​

① 基因毒性试剂：药物合成过程中使用的原料、反应试剂或催化剂，其本身具有警示结构，在合成反应中未完全反应，从而引入到中间体或药物粗品中。​

② 基因毒性合成产物：在药物合成过程中，两种或多种合成物料或试剂在特定化学反应条件下生成具有警示结构的杂质，这类杂质可能是副产物，也可能是药物合成中间体。​

③ 基因毒性降解产物：原料药或制剂本身不具有警示结构，但在储存或运输过程中发生氧化或还原等反应，最终生成具有警示结构的杂质。​

基因毒性杂质申报资料的监管已受到药监部门的高度重视，FDA、ICH、EMA 和 CFDA 均对药品申报文件中有关基因毒性杂质的控制提出了严格要求。​

3、基因毒性杂质的分类​

目前，确定某种物质是否具有基因毒性，主要通过毒理学评估手段，以体外 Ames 实验为主，辅以部分体内实验进行补充。​

自然界中化合物种类繁多，若对药物合成过程中涉及的所有化合物都进行毒理学评价，以此判别它们是否为基因毒性杂质，这种方法成本高、周期长，在实际研究工作中难以实施。​

通过对化学物质的结构与毒理学活性相关性的研究发现，某些官能团或亚结构单元能与生物体内一些功能性大分子发生反应，引发基因突变，这些对生物活性具有警示作用的官能团或亚结构单元统称为 “警示结构”。​

在研究中利用这种 “警示结构” 来判断化合物是否具有基因毒性，能使药物中基因毒性杂质的确定更快捷，研究更具针对性，极大地为药物中基因毒性杂质的研究工作提供了便利。​

Ashby 等人总结了一些易致癌化学物质的结构单元，提出了具有 18 种警示结构的化合物模型，即 “超级致癌物”。​

EMA 和 FDA 指南都认为，结构评估是研究药物中基因毒性杂质的一种有效方法。常用的结构评估商业软件有 DEREK 和 Mcase 等，也可使用基于 Ashby 和 Tennant 提出的简单警示系统，结合相关资料和研究，将警示基团分为 20 类。​

FDA 还推荐使用 MC4PC 等软件对化合物进行结构评估，以更准确地衡量化合物的毒性，为药物中基因毒性杂质的研究提供参考。​

需要注意的是，含有警示结构并不一定意味着该物质具有遗传毒性，而确认有遗传毒性的物质也不一定会产生致癌作用。物质的理化性质及其结构特点(如相对分子质量、亲水性、分子对称性 / 空间位阻、反应活性以及生物代谢速率等)可能会对其毒性起到抑制或调节作用。警示结构的重要意义在于，它提示了可能存在的遗传毒性和致癌性，为杂质进一步的安全性评价和控制策略的选择指明了方向。​

4、基因毒性杂质的限度​

2004 年，EMA 发布的基因毒性杂质限度指南(草案)采用 “最低合理可行” 的概念，默认全面消除风险难以实现，因此建议采用毒理学关注阈值 TTC 作为基因毒性杂质的可接受限度。​

TTC 概念的应用，使得在没有任何体内数据时，能够在足够安全的基础上建立杂质控制限度。这一概念对企业和监管机构都有益处，可避免不必要的毒理学研究和安全性评估。​

然而，该草案未明确短期临床试验的允许限度，在某些短期临床研究中，也不得不接受 TTC 的终生暴露限值。因此，在行业发展的需求下，“阶段化 TTC” 概念应运而生。​

美国药物研究和制造商协会于 2006 年开发了一套基因毒性杂质检测、分类、界定和独立风险评估的程序。根据积累剂量定义暴露风险的原则，提出了阶段化 TTC 概念。​

有些物质的结构基团被认定为具有较高的效价，从理论上讲，即使摄入量低于 TTC 水平，仍可能导致显著的癌症风险。基于此，应进行风险评估，以决定是否需要采取进一步行动。根据诱变性和致癌性，可将杂质分为 5 类。​

在药物基因毒性杂质的研究中，确定杂质的个数和种类后，需计算其在药物中的可接受限度。​

药物生产过程中可能涉及多种基因毒性杂质，因此在计算杂质限度时，还应注意以下两点原则：​

① 当多种基因毒性杂质存在于原料药中时，只要杂质结构(指警示结构)不相关，1.5 μg・d⁻¹ 的 TTC 限度可适用于单个杂质。​

② 当原料药中存在一种以上的基因毒性杂质时，1.5 μg・d⁻¹ 的 TTC 值适用于每一个结构不相关的杂质。若结构相似，基因毒性杂质的作用模式可能一致，且具有相同的分子靶向，在这种情况下，建议该类基因毒性杂质的总和为 1.5 μg・d⁻¹。​

明确杂质限度后，就需要确定杂质分析的限度测试浓度，包括选择适宜的分析仪器和样品处理方法。确定好分析方法后，还需对方法进行优化和方法学验证。​

5、基因毒性杂质的检测方法​

基因毒性杂质的化学结构种类多样，如何针对特定的基因毒性杂质选择最合适的分析方法，是药物中基因毒性杂质研究的重点和难点。​

总结基因毒性杂质分析研究中各种分离方法和检测器的特点，可为药物中基因毒性杂质分析方法的选择提供参考。​

由于基因毒性杂质种类繁多，在药物中含量低且结构差异大，所以针对不同的待测物需选择不同的样品前处理方法。如何提高检测方法的灵敏度和专属性，是药物中基因毒性杂质研究的重点和难点。​

基因毒性杂质检测方法主要集中在以下三个方面：​

① 选择先进的分析仪器，如 GC-MS、LC-MS 等方法：质谱检测器灵敏度高，适用于微量或痕量物质的检测，且专属性好。​

② 采用衍生化技术：通过衍生化方法增加基因毒性杂质的稳定性，或生成易于检测的衍生化产物，从而提高分析检测的灵敏度。​

③ 基质钝化：采用萃取或 SPE 等方法，除去大部分基质以减少对待测物的干扰，同时达到富集待测物的目的，提高分析方法的灵敏度。​

根据相关法规和文献报道，可总结出药物中常见基因毒性杂质的处理方法供参考。​

一种药物中可能含有多种基因毒性杂质，这就可能需要建立多种检测方法对其分别进行测定，多种检测方法的结果相互印证。​

6、基因毒性杂质的研究难点和问题​

鉴于基因毒性杂质限度低、结构多样、化学性质活泼等特点，相关研究面临诸多难点，主要体现在以下几个方面：​

① 基因毒性杂质种类多，理化性质差异大。针对某一种药物中基因毒性杂质的检测，可能需要开发多种研究方法，各方法的研究结果相互补充，以满足测定要求。​

② 基因毒性杂质稳定性差。这类杂质多含有活泼的官能团，容易与介质等发生反应，或自身易发生氧化、还原、分解等反应，在样品分析过程中可能需要加入稳定剂或进行衍生化处理来解决稳定性问题。​

③ 基因毒性杂质限度较低。检测时通常会配制高浓度的供试品，以达到设定的检测限。在液质方法检测中，高浓度的供试品可能会出现析出、堵塞色谱柱、污染离子源、产生基质效应以及干扰待测物出峰等问题，增加了检测难度。在实际研究中，可以通过改变溶剂组分使供试品析出，或采用 SPE 等其他方法除去高浓度的基质。在设定液质条件时，还可以将主成分的色谱峰切出质谱。​

④ 药物降解过程中产生的基因毒性杂质检测难度大，相关报道也较少，降解产物基因毒性杂质应引起有关方面的关注。​

⑤ 溶解性问题。一般供试品浓度较高，需要选择合适的溶样液体系，使潜在的基因毒性杂质完全溶解，确保检出结果的可靠性;基因毒性杂质理化性质差异大，在实验初期，要选择合适的溶剂，使对照品完全溶解，同时溶剂对待测物无干扰，且溶剂也可能会影响待测物的稳定性。​

⑥ 一些未知物质给测定带来不确定影响。某些药物的光学异构体具有基因毒性，对于制剂中异构体的检测可采用正相色谱，通常需要通过富集和衍生化，去除辅料的干扰，提高检测灵敏度。​

⑦ 基因毒性杂质限度低，一般需要使用液相质谱或气相质谱联用技术，而质谱检测方法作为药品的日常检测手段，会增加企业的成本。​

⑧ 企业对药物工艺路线中涉及的基因毒性杂质来源评估不全面。没有全面考虑起始物料、试剂、溶剂等可能带入的基因毒性物质，对工艺过程中可能产生的基因毒性杂质也没有充分评估等。​

7、讨论​

由于药物中基因毒性杂质存在限度要求低、化学性质活泼等原因，测定方法需要具备较高的灵敏度。通常将衍生化或 SPE 等样品处理方法与液质和气质检测仪器相结合。药物中基因毒性杂质的限度检查研究关注药物中痕量的毒性杂质，拓宽了药物质量控制的范围，为药物临床应用的安全性提供了保障。​

恒谱生目前已推出专业的基因毒杂质分析方法开发服务项目，在基因毒性杂质检测领域拥有丰富的实践经验，能够为药物研发和生产企业提供专业、可靠的检测方法开发支持，助力企业更好地应对基因毒性杂质检测的难题，保障药品质量与用药安全。