多肽药物有关物质分析方法开发的关键策略与实践​！

作为介于小分子化学药物与生物大分子药物之间的特殊品类，多肽药物凭借高特异性、低毒性的优势，在代谢性疾病、肿瘤、抗感染等领域的研发热度持续攀升。然而，多肽分子独特的理化性质与复杂的杂质谱(尤其是结构相近的肽相关杂质)，使其有关物质分析成为药物研发与质量控制的核心难点。下面小编将围绕多肽药物的分子特性，系统梳理反相色谱、离子交换色谱、体积排阻色谱等主流分析技术的开发要点，为多肽药物的质量合规提供全面参考。​

一、多肽分子特性对有关物质分析的核心影响​

多肽药物由氨基酸通过肽键连接形成，其分子结构与理化性质的特殊性，直接决定了有关物质分析方法的开发难度，主要体现在以下四方面：​

(一)分子量与色谱行为的关联​

多肽分子量通常在 500-5000 Da 之间(如明星药物司美格鲁肽分子量达 4114 Da)，虽低于生物大分子，但远高于小分子药物。较大的分子量导致其在流动相中扩散速率慢，易引发柱效下降、峰宽增加;同时，多肽对有机相比例(B%)极为敏感，微小变化(如 ±1%)即可导致保留时间大幅波动，增加方法稳定性控制难度。​

(二)高级结构的干扰​

多肽链可通过 α 螺旋、β 折叠形成二级 / 三级结构，仅表面氨基酸残基能与色谱固定相接触，导致相同序列多肽可能因构象差异表现出不同色谱行为，影响杂质与主成分的分离效果。​

(三)顺反异构体的峰型问题​

肽键(酰胺键)具有部分双键性质，易形成顺反异构体，尤其在分析含脯氨酸等残基的多肽时，易出现峰型展宽、分裂，降低检测灵敏度。​

(四)两性属性与杂质谱复杂性​

多肽分子同时含羧基(酸性)与氨基(碱性)，存在特定等电点(pI)，在不同 pH 条件下电离状态差异显著;且合成过程中易产生差相肽(如缺失 / 多余氨基酸、氨基酸取代)、降解杂质(如氧化、水解产物)，这些杂质与主成分结构高度相似，色谱行为接近，分离难度极大。​

正如国家药监局药审中心(CDE)在《合成多肽药物药学研究技术指导原则》中强调，多肽药物有关物质分析需针对性解决 “杂质与主成分分离难、方法稳定性差、定量准确性低” 三大痛点，这也要求方法开发过程中需结合分子特性进行系统性优化。​

二、主流色谱技术在多肽有关物质分析中的应用与优化​

目前，多肽药物有关物质分析以高效液相色谱(HPLC)技术为主，根据分离机制不同，可分为反相色谱(RP-HPLC)、离子交换色谱(IEC)、体积排阻色谱(SEC)三类，其中反相色谱因适用性广成为首选，后两类可作为补充技术解决复杂杂质分离问题。​

(一)反相色谱法(RP-HPLC)：多肽有关物质分析的核心技术​

反相色谱通过多肽分子与固定相(如 C18)的疏水相互作用实现分离，适用于大多数多肽药物的有关物质检测，其方法优化需重点关注色谱柱选择、流动相配置及关键参数调控三方面。​

1. 色谱柱选择：适配多肽分子扩散与结构特性​

多肽分子扩散慢、易与固定相产生非特异性吸附，色谱柱的选择直接决定分离效率与方法稳定性，需从以下维度考量：​

填料类型：表面多孔型硅胶填料(如核壳结构)可缩短多肽分子在颗粒内部的扩散路径，减少谱带展宽，显著提升柱效，尤其适用于分子量 > 2000 Da 的多肽;全多孔硅胶填料则需选择小粒径(如 1.7-3 μm)，虽会增加柱压，但对多肽分离的收益优于小分子药物。​

孔径选择：10-12 nm 孔径的色谱柱可满足多数多肽需求，既能允许多肽分子进入孔隙与固定相结合，又可避免因孔径过小导致的传质阻力增加。​

固定相键合相：C18 是基础选择，可提供强疏水作用;对于含酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族残基的多肽，苯基柱(如 Phenyl-Hexyl)可通过 π-π 相互作用增强选择性;此外，封端 / 不封端、嵌合极性基团(如氨基、氰基)的色谱柱，可减少硅醇基与多肽氨基的次级相互作用，改善峰型。​

由于不同厂家色谱柱的选择性差异较大(如键合密度、端基封尾工艺)，方法开发阶段需通过多柱筛选确定最优方案。例如，可参考 Snyder/Dolan 法(通过 H、S、A、B、C 参数表征选择性)或借助供应商数据库筛选差异显著的色谱柱;若需提升效率，采用自动化方法开发平台(如集成多柱切换、智能梯度优化功能)可大幅缩短筛选周期 —— 这与专业机构的技术路径高度契合，例如恒谱生在多肽方法开发与验证中，便依托自主研发的多柱筛选技术与设备，结合 10 万 + 化合物潜库比对，快速定位适配的色谱柱类型，解决 “盲目试柱、效率低下” 的痛点。​

2. 流动相配置：平衡保留、选择性与峰型​

流动相需兼顾多肽的保留能力、杂质分离度与溶解度，关键优化方向包括：​

缓冲体系：三氟乙酸(TFA)是首选添加剂，浓度通常为 0.1%(V/V)，其不仅能提供稳定的 pH 环境(约 2.0)，还可与多肽氨基形成离子对，增强疏水保留;若需更高离子强度，可选用 50 mmol/L 磷酸盐缓冲液，减少多肽分子间的排斥作用，改善峰型展宽;对于难分离杂质，可加入离液剂(如六氟磷酸铵、高氯酸钠)，通过改变水相极性调整选择性，且其在乙腈 – 水体系中溶解度更高，避免结晶析出。​

pH 调控：需根据多肽等电点(pI)设定流动相 pH，通常避开 pI±1.0 范围(防止多肽溶解度骤降、析出堵塞色谱柱);例如，pI=7.0 的多肽，可选择 pH=5.0 或 pH=9.0 的流动相，通过改变多肽电离状态优化保留与分离。​

有机相选择：乙腈是主流有机相，因其紫外吸收低、粘度小，可减少基线噪音与柱压，且峰型优于甲醇、异丙醇;若部分杂质与主成分分离度不足，可少量添加甲醇(5%-10%)或异丙醇，通过调整疏水相互作用强度改变选择性。​

梯度程序：鉴于多肽对 B% 敏感，需采用缓慢梯度(如每 10 分钟增加 5%-10% 乙腈)，避免保留时间波动过大;例如，分析含 10-20 个氨基酸的多肽时，可设置初始 B% 为 5%，维持 5 分钟后以 0.5%/min 的速率升至 40%，确保杂质与主成分充分分离。​

3. 关键参数优化：提升方法稳定性与灵敏度​

柱温：高柱温(如 40-60℃)可降低流动相粘度、加速多肽分子扩散，改善峰型与分离度，还能抑制肽键顺反异构，减少峰分裂;但需注意，高温可能导致多肽降解(如 Asp-Pro 键水解)或缩短色谱柱寿命，需通过强制降解试验验证稳定性，必要时对柱前流动相进行预热。​

检测波长：多数多肽缺少共轭结构，需选择酰胺键的末端吸收波长(210-220 nm)，虽基线噪音较高，但灵敏度优于芳香族残基的吸收波长(如 280 nm);若多肽含色氨酸、酪氨酸，可采用双波长检测(如 214 nm 与 280 nm)，辅助确认杂质与主成分的一致性。​

稀释液匹配：需确保样品稀释液的 pH 与溶剂强度和初始流动相一致，避免因溶剂效应导致峰型展宽或保留时间偏移;例如，初始流动相为 0.1% TFA – 水(95:5)，稀释液也应采用相同体系。​

仪器选择：超高效液相色谱(UPLC)因高柱效、高流速特性，是多肽分析的首选;若使用常规 HPLC，需选择低死体积系统(如小径管路、低扩散进样阀)，减少系统峰展宽。​

(二)离子交换色谱法(IEC)：复杂杂质分离的补充技术​

当反相色谱无法有效分离极性差异显著的杂质(如强酸性 / 碱性降解产物)时，离子交换色谱可通过多肽与固定相的静电相互作用实现分离，其核心优化方向如下：​

1. 流动相设计​

缓冲液：需根据多肽 pI 设定 pH，阳离子交换色谱(CEC)的 pH 应低于 pI 1.0 以上(使多肽带正电，与固定相磺酸基结合)，阴离子交换色谱(AEC)的 pH 应高于 pI 1.0 以上(使多肽带负电，与固定相季铵基结合);磷酸盐是首选缓冲盐，可通过调整浓度(20-100 mmol/L)调控离子强度。​

反离子：通过改变反离子种类与浓度调整保留强度，例如 CEC 中可选用 Na⁺、K⁺(保留强度：Na⁺

有机相：添加 5%-15% 乙腈可减少多肽与固定相的疏水相互作用，改善峰型，避免非特异性吸附。​

2. 色谱柱选择​

载体：硅胶载体需选择宽 pH 耐受范围(如 2-10)的类型，聚合物载体(如苯乙烯 – 二乙烯基苯)则适用于极端 pH 条件(如 1-13)，但柱效略低于硅胶载体。​

固定相：强阳离子交换(SCX，含 – SO₃⁻)、强阴离子交换(SAX，含 – N (CH₃)₃⁺)适用于大多数多肽，弱离子交换固定相(如 – WCX 含 – COOH、-WAX 含 – NH₂)则适用于易降解的多肽。​

3. 其他参数​

柱温、流速可参考反相色谱，通常柱温设为 30-40℃，流速 1.0-1.5 mL/min，确保分离效率与峰型稳定。​

(三)体积排阻色谱法(SEC)：聚合物杂质分析的专属技术​

体积排阻色谱通过多肽分子体积差异实现分离，主要用于检测多肽药物中的聚合物杂质(如二聚体、多聚体)，其方法优化需聚焦色谱柱与流动相适配性：​

1. 色谱柱选择​

填料：优先选择硅胶表面修饰二醇基的填料，可减少多肽与硅胶的疏水作用和静电相互作用，避免吸附;孔径选择 12 nm，可满足分子量 1000-10000 Da 多肽的聚合物分离需求。​

粒径：选择 3-5 μm 小粒径填料，提升柱效，改善聚合物与主成分的分离度;色谱柱长度通常为 300 mm，确保充分分离。​

2. 流动相设计​

缓冲体系：可选用 0.1% TFA 或 50 mmol/L 磷酸盐缓冲液，调控 pH 至多肽可溶性范围(避开 pI±1.0)，同时加入 0.1%-0.5% NaCl 提升离子强度，减少静电吸附。​

有机相：添加 20%-30% 乙腈或甲醇，降低多肽与填料的疏水相互作用，改善峰型;需注意有机相比例不可过高，避免多肽析出。​

流速：因多肽分子扩散慢，需采用低流速(0.5-0.8 mL/min)，延长保留时间，提升柱效;若流速过快，易导致聚合物峰与主成分峰重叠。​

3. 系统适用性​

需验证色谱柱的分子量排阻范围，确保主成分与聚合物杂质的保留时间差异显著，且理论塔板数符合要求(通常 > 2000)。​

三、多肽有关物质方法开发的关键原则与验证要点​

多肽有关物质方法开发是系统性工程，需遵循 “针对性优化、多技术互补、全流程验证” 三大原则，同时结合法规要求完成方法验证，确保方法的科学性与合规性。​

(一)方法开发核心原则​

基于分子特性设计方案：先通过氨基酸序列分析多肽的 pI、疏水基团含量、易降解位点(如 Met、Cys 易氧化，Asp-Pro 易水解)，初步确定色谱模式(如疏水强的多肽优先选反相色谱，极性强的多肽优先选离子交换色谱)。​

多色谱模式互补：单一色谱模式难以覆盖所有杂质，需结合反相、离子交换、体积排阻色谱进行 “正交验证”，例如反相色谱检测差相肽与降解杂质，离子交换色谱检测极性杂质，体积排阻色谱检测聚合物杂质，确保杂质无遗漏。​

借助技术工具提升效率：面对复杂的参数筛选(如色谱柱、pH、梯度)，可采用自动化方法开发平台或专业技术服务支持，缩短方法开发周期，降低试错成本。​

(二)方法验证关键指标​

根据《药品质量标准分析方法验证指导原则》(ChP 2020 年版)，多肽有关物质方法需重点验证以下指标：​

专属性：通过空白基质干扰试验(确认辅料无干扰)、强制降解试验(酸、碱、氧化、高温、光照降解)，验证主成分与各杂质峰的分离度 > 1.5;若采用质谱检测，需确认杂质的分子量与结构，避免假阳性。​

线性与范围：针对主成分与主要杂质，配制 5 个浓度梯度(通常覆盖定量限至 120% 限度浓度)，线性回归系数 R²>0.999.确保定量准确性。​

准确度与精密度：准确度通过低、中、高(80%、100%、120% 限度浓度)加标回收率验证，回收率应在 90%-110% 之间;精密度包括日内精密度(同一时间 6 次进样，RSD<5%)与日间精密度(不同时间 3 天进样，RSD<8%)，确保方法稳定性。​

检出限(LOD)与定量限(LOQ)：通过信噪比法(S/N=3 为 LOD，S/N=10 为 LOQ)或空白基质加标法确定，LOQ 需满足杂质限度的检测需求(通常 LOQ<50% 杂质限度)。​

系统适用性：每次检测前需验证理论塔板数(>3000)、分离度(>1.5)、拖尾因子(0.8-1.2)、重复进样 RSD(<2%)，确保色谱系统稳定。​

梯度重现性：连续进样 6 次，考察流动相梯度对保留时间、峰面积的影响，保留时间 RSD<2%，峰面积 RSD<5%，避免因梯度波动导致杂质漏检。​

四、总结与专业技术服务参考​

多肽药物有关物质分析方法开发面临 “分子特性复杂、杂质分离难、方法稳定性要求高” 三大挑战，需结合反相、离子交换、体积排阻等多色谱技术，从色谱柱、流动相、仪器参数等维度进行系统性优化。未来，随着多肽药物向长链化、修饰化(如 PEG 化、脂肪酸修饰)方向发展，有关物质分析将面临更高要求，需进一步借助智能化方法开发工具、高分辨检测技术(如 UHPLC-Q-TOF)，以及专业技术服务支持。​

在实际操作中，企业可依托专业机构的技术能力提升方法开发效率与合规性。例如恒谱生针对多肽药物有关物质分析的痛点，提供 “开发 + 验证” 全流程一站式服务，依托 UPLC-MS/MS、制备色谱等高精度设备，结合自主研发的多柱筛选、梯度优化技术，可解决 “方法难开发、验证不达标、数据不可靠” 等问题;同时其推出的反相 C18-AR 色谱柱、Phenyl 苯基柱、CN氰基柱、SEC-Bio 色谱柱等产品，可适配多肽药物不同分离场景需求，助力企业突破技术瓶颈，确保方法科学、准确、合规落地，为多肽药物研发与生产的质量控制提供有力支撑。​