黄芪多糖的提取、分离与纯化方法！

黄芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS)是黄芪的主要活性成分之一，其提取、分离与纯化工艺直接影响后续的结构分析及活性研究。下面恒谱生分析检测中心介绍从黄芪饮片出发，经脱脂、水提、醇沉、脱蛋白、膜分离及柱色谱分离等一系列步骤，获得不同分子量范围均一组分的完整流程。

一、黄芪多糖的提取与脱蛋白

1. 粗多糖的提取

取黄芪饮片5 kg，粉碎后加入5倍量无水乙醇，回流脱脂2次，每次2小时。脱脂后的药渣干燥，加入8倍量蒸馏水浸泡过夜，加热提取3次，每次2小时。合并提取液，浓缩至适当体积，加入95%乙醇使乙醇终浓度达到80%，4℃静置48小时。离心弃上清，沉淀用相同方法重复醇沉一次，得黄芪粗多糖。

2. 三氯乙酸法脱蛋白

将粗多糖用3500 mL蒸馏水超声溶解，搅拌下缓慢加入等体积5%三氯乙酸(TCA)溶液，混匀后4℃冷藏24小时。取出后3500 r·min⁻¹离心15分钟，收集上清液。用饱和碳酸氢钠(NaHCO₃)溶液调pH至中性，浓缩至3000 mL。再加入95%乙醇至醇浓度80%以上，室温静置24小时，离心取沉淀，真空干燥，得脱蛋白后的黄芪多糖(APS)。

二、黄芪多糖的膜分离(分子量分级)

将上述APS用蒸馏水超声溶解1小时，定容至3500 mL，转移至膜分离系统储液罐中。采用中空纤维膜，按分子量截留值由大到小依次分离。

操作步骤：

首先安装150 kDa膜，调节压力0.1 MPa，保持恒定流速。截留液返回储液罐，滤液进入滤液罐。随着储液罐液面下降，适时补充蒸馏水冲洗，直至滤液经Molish反应(取1 mL滤液，加等体积10% α-萘酚醇溶液，沿管壁滴加浓硫酸，无棕色环出现)证实不含多糖为止。

收集截留液(>150 kDa)，并用少量蒸馏水反清洗膜表面，合并至截留液中。

将滤液(<150 kDa)转移至储液罐，依次更换100 kDa、50 kDa、20 kDa、10 kDa、6 kDa的膜，重复上述操作。

最终得到7个不同分子量范围的黄芪多糖组分：

APS-A：>150 kDa

APS-B：150～100 kDa

APS-C：100～50 kDa

APS-D：50～20 kDa

APS-E：20～10 kDa

APS-F：10～6 kDa

APS-G：<6 kDa

各组分浓缩后冷冻干燥，备用。

三、黄芪多糖的含量测定(苯酚-硫酸法)

1. 葡萄糖标准曲线的绘制

精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品10 mg，蒸馏水溶解并定容至100 mL，得0.1 mg·mL⁻¹标准溶液。分别精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于具塞试管中，加水补至2.0 mL。各加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀后迅速加入浓硫酸5.0 mL，混匀，室温放置10分钟，再于40℃水浴保温15分钟，取出迅速冷却至室温。以蒸馏水同法处理作空白，于490 nm波长处测定吸光度。以葡萄糖浓度(mg·mL⁻¹)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2. 样品含量测定

精密称取干燥的多糖样品10 mg，蒸馏水定容至100 mL。取2.0 mL样品溶液，按上述“标准曲线绘制”项下方法操作，于490 nm测定吸光度，平行测定3次取平均值，代入标准曲线计算多糖含量。

四、脱蛋白率测定(考马斯亮蓝法)

1. 试剂制备

精密称取50 mg考马斯亮蓝G-250.用25 mL 95%乙醇溶解，加入50 mL 85%(W/V)磷酸，蒸馏水定容至500 mL，得0.01%(W/V)染色液。

2. 蛋白质标准曲线的绘制

精密称取牛血清白蛋白10 mg，蒸馏水溶解并定容至100 mL，得0.1 mg·mL⁻¹标准溶液。分别量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，加水至1.0 mL，加入5.0 mL考马斯亮蓝染色液，混匀，放置3分钟。以蒸馏水同法处理作空白，于595 nm处测定吸光度。以蛋白质浓度(mg·mL⁻¹)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

3. 样品测定与脱蛋白率计算

精密量取脱蛋白前后的黄芪多糖溶液各1.0 mL，按上述方法测定吸光度，计算蛋白质含量。脱蛋白率按下式计算：

脱蛋白率(%)=(1−脱蛋白后蛋白含量脱蛋白前蛋白含量)×100%脱蛋白率(%)=(1−脱蛋白前蛋白含量脱蛋白后蛋白含量​)×100%

五、黄芪多糖的柱色谱分离与纯化

1. DEAE-Cellulose-52 离子交换柱色谱

分别称取膜分离后的各组分(APS-A~G)1 g，溶于100 mL蒸馏水，离心取上清。上样于DEAE-Cellulose-52色谱柱(80 cm × 3 cm)，依次用蒸馏水、0.1 mol·L⁻¹ NaCl、0.2 mol·L⁻¹ NaCl溶液进行梯度洗脱，每管收集5 mL。采用苯酚-硫酸法测定每管490 nm吸光度，绘制洗脱曲线。合并主峰流分，透析脱盐，浓缩后冷冻干燥。

(同时取未经膜分离的APS原样，按相同条件进行离子交换柱色谱分离，作为对照。)

2. Sephadex G-100 凝胶柱色谱

取经DEAE分离得到的各组分0.15 g，溶于10 mL蒸馏水，离心取上清。上样于Sephadex G-100色谱柱，用蒸馏水洗脱，每管收集5 mL。苯酚-硫酸法测定490 nm吸光度，合并单一对称峰的组分，透析后冷冻干燥，得到分子量均一的黄芪多糖精制组分。

总结

本文系统建立了黄芪多糖的提取、脱蛋白、膜分离分级、柱色谱纯化及含量测定的完整方法。通过TCA法有效去除蛋白，膜分离技术实现分子量范围的初步分级，再结合离子交换与凝胶过滤色谱，可获得不同电荷特性和分子量均一的黄芪多糖组分。这一方法体系为黄芪多糖的结构分析、活性筛选及质量控制提供了可靠的技术支撑。