方法开发 | 流动相的选择，决定了分离的成败！

在上一期内容中，我们讨论了方法开发的起点——读懂化合物结构。只有弄清楚目标物的酸碱性、官能团等内在性质，才能为后续的色谱柱和流动相选择提供科学依据。分析结构的酸碱性是最基础也是最关键的第一步。本期，我们将聚焦流动相，剖析流动相与化合物结构之间的关系。

在常规反相色谱中，流动相通常由缓冲盐溶液和有机相组成。不同缓冲盐与有机相可以两两组合成多种体系(前提是两者互溶)。下面先从有机相说起。

一、有机相的选择

除了甲醇和乙腈，反相体系中偶尔也会用到异丙醇、乙醇、叔丁醇、四氢呋喃（THF）。这些溶剂通常与甲醇或乙腈混合使用，添加比例在20%左右。醇类随着碳链增长粘度增大，使用高比例醇类时应适当降低流速，以免超过色谱柱耐压。THF容易被氧化，市售产品常添加抗氧化剂BHT(2.6-二叔丁基对甲酚)，此时截止波长约为260 nm。若方法需要在低波长下检测且必须使用THF，应选择不含BHT的THF，并尽量现开现用。存放过久的THF可能生成过氧化物，导致化合物降解或基线漂移。此外，THF对PEEK材质有一定溶胀作用，流动相中含THF时应避免使用PEEK管路和接头。

什么时候需要用到这些特殊有机相？ 当甲醇、乙腈及其混合体系尝试后仍无法分离某些杂质时，可以尝试THF或醇类。对于非对映异构体、位置取代异构体等常规反相难以分离的结构，特殊有机相有时能带来意想不到的效果。

二、缓冲盐的选择

有机相的种类相对有限，而缓冲盐的选择则丰富得多。常见类型包括：

●  磷酸盐、乙酸盐/甲酸盐、碳酸盐

●  传统离子对试剂：烷基磺酸钠、四丁基铵盐

●  离液剂：六氟磷酸盐、高氯酸盐、硫酸盐

●  曾经流行但现已少用的：氯化盐等

1. pH与保留行为的关系

提到缓冲液，pH是一个绕不开的话题。流动相的pH与化合物pKa之间的关系，是方法开发的核心知识点。下面展示了pH对酸性、碱性、中性化合物保留时间的影响：

●  中性化合物的保留基本不受pH影响

●  酸性化合物在酸性条件下保留最强

●  碱性化合物在碱性条件下保留最强

这是因为当pH抑制化合物电离后，分子态形式增强了疏水作用，从而提高了保留。

2. 各类缓冲盐的特点

磷酸盐：UV截止波长低，对低波长检测(如210 nm以下)友好，拥有三个缓冲范围(pKa2=2.1.pKa2=7.2.pKa3=12.3)，选择性丰富。缺点是高有机相比例下可能析出，使用时应注意有机相比例不宜过高。

乙酸铵/甲酸铵：与有机相互溶性好，具有挥发性，是LC-MS的首选。但UV截止波长约210 nm，对低波长检测不够友好。另外，乙酸相比磷酸具有一定离子对性质，呈现出不同的选择性。

三氟乙酸（TFA）：由于氟的强吸电子效应，TFA具有较强的离子对特性，可以显著改善碱性化合物的峰形。类似的添加剂还有五氟丙酸、七氟丁酸、九氟戊酸，碳链长度不同，保留能力和选择性也有差异。需要注意的是，TFA进入质谱时会抑制负离子响应，因此只能用于正离子模式。

传统离子对试剂(如烷基磺酸钠、四丁基铵盐)：曾经用于反相中不保留的强极性物质，但由于其对色谱柱造成不可逆改性、平衡时间过长，目前已逐渐淡出常规应用，取而代之的是Hilic模式、混合模式以及新型离液剂。

离液剂(六氟磷酸盐、高氯酸盐、硫酸盐)：不会改性色谱柱，且能改善碱性化合物峰形。六氟磷酸盐和高氯酸盐的UV截止波长较低(优于TFA的210 nm)。其中高氯酸盐与有机相的互溶性更好，但两者均无挥发性，无法用于质谱。特别注意：离液剂本身没有缓冲能力，不能单独使用，必须与缓冲盐配合。

硫酸盐：常用于多肽及蛋白药物的分析，例如药典中胰岛素的有关物质方法即使用0.2 mol/L硫酸盐缓冲液。

盐酸盐（如氯化钠、氯化铵）：因氯离子会腐蚀不锈钢管路，已不再优先作为流动相使用。

3. 缓冲容量——容易被忽视的关键

缓冲容量是指流动相抵抗pH变化的能力。当缓冲能力不足时，即使加入少量样品也可能引起pH明显波动，进而影响保留时间的重现性。以下措施可以有效提高缓冲容量：

（1）缩小缓冲液pKa与流动相pH之间的差距(例如磷酸盐一级电离的缓冲范围在pH 2~3.5.若目标pH=4则缓冲能力不足)

（2）拉大流动相pH与溶质pKa之间的差距(通常建议pH避开pKa ± 1.5范围，此时缓冲容量的影响变小)

（3）提高缓冲盐浓度(浓度不够，浓度来补)

（4）减小进样体积(降低样品扩散对缓冲的冲击)

（5）调节样品溶液pH与流动相一致(避免样品本身消耗缓冲能力)

三、恒谱生技术建议：实用的初始条件

基于以上原理，我们给出以下起始条件建议：

对于酸性化合物(主要指含羧基的物质;若含磷酸酯可能因金属络合拖尾，含磺酸基则常规酸难以抑制电离)：初始缓冲液推荐 0.1% 磷酸水溶液(pH≈2.1)。

对于碱性化合物或两性化合物：初始缓冲液推荐 0.1% 磷酸 + 20 mM 六氟磷酸钾（或20 mM高氯酸钠）(pH≈2.1)。

上述两种体系pH均在2.1左右，避开了大多数酸性及碱性化合物的pKa，不易出现保留时间漂移，方法耐用性好。

对于杂质的分离，可以通过筛选不同色谱柱和有机相来实现。如果两个难以分离的物质存在pKa差异，调节pH仍然是一个有效手段。但需要注意：当pH落入化合物pKa ± 1.5范围内时，pH的微小波动会导致保留时间显著变化，此时必须充分考察方法的耐用性。

此外，在反相体系中，钠盐和钾盐的性能通常没有区别。但六氟磷酸钾的价格比六氟磷酸钠便宜很多;而高氯酸盐属于管控物料，购买时需要具备相应资质。

恒谱生技术团队 致力于为色谱工作者提供实用的方法开发思路。如果您在流动相选择或方法开发中遇到任何问题，欢迎随时交流探讨。