HPLC液相色谱常见的10个操作错误：这些细节可能影响分析结果

液相色谱实验中，遇到过这些情况吗？

刚换完样品，系统压力开始升高；同一个样品重复进样，峰面积却不稳定；换了一套流动相，基线一直不平；前几次分析还正常，过了一段时间色谱柱压力越来越高。

遇到这些问题，很多人第一反应是怀疑仪器或者色谱柱。

但在实际使用中，一些看起来很普通的操作，同样可能影响液相色谱系统的运行状态和分析结果。尤其是刚开始接触HPLC时，有些细节很容易被忽略。

下面整理10个比较常见的操作问题，平时做实验时可以逐项检查。

1. 样品不过滤就直接进样

常见表现：进样后压力升高，或者使用一段时间后柱压越来越高。

样品即使肉眼看起来澄清，也可能存在没有完全溶解的颗粒。直接进样后，这些颗粒可能进入进样针、管路、在线过滤部件或者色谱柱入口，逐渐造成污染或堵塞。

特别是提取液、反应液、含有辅料的样品，以及放置后容易产生沉淀的样品，更需要注意。

解决：进样前根据样品性质选择合适的滤膜进行过滤，常见孔径为0.22 μm和0.45 μm。

滤膜孔径和材质都需要结合样品以及分析方法选择，不是所有样品都必须固定使用0.22 μm滤膜。

2. 泵没有排气，就直接开始分析

常见表现：压力波动、流量不稳定，基线出现异常。

更换流动相、溶剂瓶见底或者仪器长时间停机后，泵头和管路中都有可能进入空气。

如果气泡没有及时排出，进入泵和检测系统后，就可能影响流动相输送的稳定性。

解决：更换流动相或重新启动仪器后，先进行排气和冲洗，确认流路稳定后，再连接色谱柱进行分析。

如果已经发现系统中存在明显气泡，也不要急着进样，应先把气泡问题处理好。

3. 含盐流动相用完，直接关机

常见表现：仪器放置一段时间后，压力升高，甚至出现管路或部件堵塞。

磷酸盐、醋酸盐等缓冲盐经常用于液相色谱分析。如果使用结束后没有及时冲洗，残留的盐可能随着溶剂组成变化而析出。

这些沉积物可能出现在泵头、管路或其他流路部件中，时间长了会影响系统正常运行。

解决：含盐流动相使用结束后，先用适当的水相充分冲洗，将系统中的盐冲洗干净，再根据仪器和色谱柱要求转换到相应的有机溶剂体系。

尤其不要在盐还没有冲干净的情况下，直接切换到高比例有机相，否则可能加剧盐析出。

4. 为了方便，用普通溶剂代替HPLC级溶剂

常见表现：基线噪声变大、出现异常杂峰，低波长检测时尤其明显。

液相色谱使用的流动相，对溶剂纯度有一定要求。

普通溶剂中的杂质可能带来额外吸收或背景干扰。在梯度分析、低波长检测以及对杂质比较敏感的分析中，这种影响会更加明显。

解决：根据分析方法要求选择HPLC级或相应等级的溶剂配制流动相，并按照要求进行过滤和脱气。

流动相不是“能把样品溶解了就可以”，溶剂纯度同样会影响分析结果。

5. 色谱柱安装时没有确认流向

常见表现：更换或重新安装色谱柱后，峰形、柱压或者分离效果出现异常。

色谱柱通常会在柱体上标注流动方向。

安装时如果没有确认流向，特别是已经使用过的色谱柱，反向使用可能影响柱床状态和分离性能。

解决：安装色谱柱前先检查柱体上的流向箭头，按照规定方向连接。

安装完成后，还需要检查接头是否安装到位。连接不规范产生的额外死体积，也可能影响峰形。

6. 样品浓度太高，超过方法线性范围

常见表现：峰面积不再与浓度成比例，峰形变差，定量结果出现偏差。

很多人第一次做样品时，会觉得浓度高一点比较容易检测。

实际上，如果样品浓度超过检测方法的线性范围，检测器响应可能不再保持良好的线性关系。浓度过高时，还可能出现峰前伸等峰形问题。

解决：先确认方法的线性范围，再根据样品浓度进行适当稀释，使待测样品处于合适的线性范围内。

对于浓度未知的样品，第一次检测时不要盲目配得过浓，可以根据预估浓度进行调整。

7. 流速一下子调得太高

常见表现：系统压力快速上升，甚至出现明显的压力波动。

液相色谱启动或者更改方法条件时，如果流速突然大幅提高，系统压力也会随之快速变化。

特别是刚安装色谱柱、系统压力本身偏高，或者更换了不同规格色谱柱时，更需要注意流速的调整。

解决：调整流速时逐步提高，同时观察系统压力，确认压力处于仪器和色谱柱允许范围内。

不同长度、内径和粒径的色谱柱，对流速的适用范围也不同，不能简单照搬原来的方法参数。

8. C18色谱柱长期用纯水保存

常见表现：色谱柱长时间放置后，再次使用时柱效、峰形或压力状态发生变化。

C18是实验室中非常常见的反相色谱柱。长期使用纯水保存，特别是在适宜微生物生长的条件下，容易产生微生物污染。

解决：C18色谱柱使用结束后，充分冲洗，再用甲醇或乙腈等适合的有机溶剂进行保存。

这里要注意，不同类型色谱柱的保存条件并不完全相同。上述方法主要针对常见C18反相色谱柱，实际使用时还应根据色谱柱填料类型以及生产厂家的保存要求进行处理。

9. 做液相时忽略柱温变化

常见表现：方法和流动相没有明显变化，但保留时间出现漂移。

温度变化是液相分析中比较容易被忽略的因素。

温度会影响流动相黏度，也会影响样品在固定相和流动相之间的分配。因此，对于部分分析方法，柱温发生变化后，保留时间和分离效果也可能随之变化。

解决：对于温度敏感的分析方法，使用柱温箱设定固定温度，并尽量保持不同批次分析的温度条件一致。

所以遇到保留时间漂移时，除了检查流速、流动相比例和系统平衡，也可以检查柱温是否发生变化。

10. 仪器用了很久，却没有留下使用记录

常见表现：仪器出了问题，却不知道问题从什么时候开始。

比如系统压力以前一直正常，最近逐渐升高。如果没有记录之前的压力、流速和进样次数，就很难判断这是突然发生的堵塞，还是系统状态已经慢慢发生变化。

解决：每次使用液相色谱仪时做好基本记录，包括流速、系统压力、柱温、进样次数、色谱柱使用情况以及异常现象等。

这些记录平时可能不起眼，但出现异常时，可以帮助快速缩小排查范围。

液相色谱出现异常，可以先从这几个地方排查

液相色谱出现异常时，不一定就是色谱柱出了问题。

例如：

所以，遇到液相色谱异常时，不建议第一时间就更换色谱柱。

先从样品、流动相、进样系统、管路、仪器参数这些环节逐项排查，往往更容易找到真正的问题。

液相色谱实验看起来都是一些基础操作，但这些细节恰恰决定了系统能不能稳定运行。把样品处理、流动相使用、色谱柱维护以及仪器记录这些环节做好，很多常见问题都能提前发现。

如果在实际检测过程中遇到压力异常、峰形异常、保留时间漂移或方法重复性不稳定等问题，也可以结合具体的样品、流动相、色谱柱和检测条件进行针对性分析。