HPLC色谱柱有哪些类型？7种常见类型及选型方法

HPLC色谱柱怎么选，不能只看C18、C8等型号，还要结合样品性质和实际分离需求。

在高效液相色谱（HPLC）分析中，不同化合物的极性、电荷、分子大小和空间结构存在差异，适用的色谱柱也可能不同。例如，常见小分子分析通常可以从反相C18柱开始尝试；如果极性化合物保留不足、两个目标峰难以分开，或者需要分离对映异构体，就可能需要考虑其他固定相或分离模式。

常见的HPLC色谱柱包括正相柱、反相柱、离子交换柱、体积排阻柱、HILIC 柱、亲和柱和手性柱。它们的分离原理、适用样品和选型重点各不相同。

恒谱生将从分离原理、常见应用和实际选型三个方面，介绍这6种色谱柱，帮助你根据样品特点缩小选择范围。

目录

1. 正相HPLC色谱柱

2. 反相HPLC色谱柱

3.离子交换HPLC色谱柱

4. 体积排阻HPLC色谱柱

4. HILIC色谱柱（亲水作用色谱柱）

5. 亲和色谱柱

6. 手性HPLC色谱柱

7. 如何选择合适的HPLC色谱柱

HPLC色谱柱的主要分离模式

HPLC色谱柱主要利用不同的分离机制实现组分分离，包括极性相互作用、疏水作用、离子相互作用和分子尺寸差异。此外，亲和色谱和手性色谱还可分别利用特异性结合和手性识别，实现特定生物分子或对映异构体的分离。

1. 正相HPLC色谱柱

常见固定相：硅胶、氨基、氰基和二醇等。

常见流动相：正己烷、正庚烷，以及乙酸乙酯、异丙醇等极性改性剂组成的溶剂体系。

常见应用

●  不同极性有机化合物的分离

●  部分脂质、烃类及异构体分析

●  适用溶剂体系下的制备分离

●  配合手性固定相进行特定手性化合物分离

选型注意事项

正相色谱的保留行为容易受到溶剂组成和含水量影响。保持流动相组成稳定，并充分平衡色谱柱，有助于提高分析结果的重复性。

正相色谱VS反相色谱工作原理

2. 反相HPLC色谱柱

反相色谱是HPLC中应用非常广泛的一种分离模式，尤其适用于药物分析、杂质检测及许多小分子化合物的分离。

反相色谱采用相对疏水的固定相和以水相为基础的流动相。分析物的疏水性、分子结构以及与固定相的相互作用存在差异，因此表现出不同的保留行为。

在其他条件相近时，疏水性较强的化合物通常具有更强的保留倾向。但实际保留顺序并不只由疏水性决定，还受到固定相选择性、流动相组成和分析物结构等因素的影响。

反相色谱采用疏水性固定相和含水流动相，通过分析物与固定相之间的相互作用差异实现分离。

常见固定相包括：

C18（十八烷基键合相）

C8（辛基键合相）

C4（丁基键合相）

苯基键合相

PFP（五氟苯基键合相）

极性嵌入型键合相

其中，C18色谱柱是许多小分子分析方法的常用起点，但并不意味着它适合所有样品。

常见流动相：

水或缓冲液与乙腈、甲醇等有机溶剂组成的体系。具体选择取决于分析物性质、检测方式和方法要求。

常见应用

●  药物含量测定及有关物质分析

●  食品、环境及化工样品分析

●  多肽及部分蛋白质的分离

●  天然产物和复杂混合物分析

●  常规分析及制备液相色谱分离

选型注意事项

选择反相色谱柱时，不能只看C18、C8等固定相名称，还应关注以下因素：

●  固定相化学性质：不同键合基团及表面性质会影响保留和选择性。

●  碳载量及封端方式：可能影响疏水性、极性化合物保留及峰形。

●  粒径：会影响柱效、背压和分析速度。

●  孔径：应与目标分子的尺寸及分离要求相匹配。

●  pH适用范围：需要符合色谱柱制造商规定的使用条件。

●  流动相与温度：会影响保留时间、选择性及方法稳定性。

3. 离子交换HPLC色谱柱

离子交换色谱根据分析物的电荷特征及其与带电固定相之间的相互作用实现分离。保留行为主要受到分析物电荷、固定相官能团、流动相pH和离子强度等因素影响。

●  阳离子交换柱：固定相通常带负电，用于保留带正电的分析物。

●  阴离子交换柱：固定相通常带正电，用于保留带负电的分析物。

常见应用

●  无机离子及部分有机酸、碱的分离

●  氨基酸、多肽、蛋白质等生物分子分析

●  蛋白质电荷变异分析及生物分子纯化

●  水质与环境样品分析

选型注意事项

分析物需要在所选pH条件下具有适当的电荷状态。合理控制缓冲液pH、盐浓度及梯度条件，有助于优化保留、选择性和回收率。

4. 体积排阻HPLC色谱柱

体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）根据分子的流体动力学体积差异进行分离，通常不依赖目标分子与固定相之间的强吸附作用。

色谱柱填料具有一定的孔径分布。较大的分子进入填料孔隙的能力较弱，经过的路径相对较短，因此通常先洗脱；较小的分子能够进入更多孔隙，路径相对较长，因此通常后洗脱。

体积排阻色谱根据分子进入填料孔隙的程度不同实现分离，较大的分子通常先于较小的分子洗脱。

常见填料包括：

●  多孔硅胶

●  多孔聚合物

●  琼脂糖等多糖基介质

相关分离模式：

SEC：通常用于水溶性生物分子或聚合物的分子尺寸分析。

GPC：凝胶渗透色谱，通常用于有机溶剂体系中可溶性聚合物的分子量及分子量分布分析。

SEC和GPC均属于体积排阻分离原理的应用，具体名称通常与样品类型和流动相体系有关。

常见应用

●  蛋白质聚集体及片段分析

●  生物分子的尺寸分布分析

●  聚合物分子量及分子量分布表征

●  部分生物样品的脱盐和分离

选型注意事项

选择体积排阻色谱柱时，应重点关注填料孔径、分离范围和样品的溶解状态。

如果目标分子尺寸超出色谱柱的有效分离范围，就可能出现分离不足。此外，分析物与填料之间不必要的离子或疏水相互作用，也可能影响分离结果。

因此，应根据样品性质选择适当的孔径和流动相条件，尽量避免非体积排阻作用对分析结果的干扰。

5. HILIC 色谱柱(亲水作用色谱柱)

HILIC(亲水作用液相色谱)是一种适用于极性化合物分离的色谱模式。当一些极性化合物在反相 C18 色谱柱上保留较弱、容易随流动相较早流出时，HILIC 色谱柱可以作为另一种分离选择。

工作原理

HILIC 通常采用硅胶、酰胺、氨基或其他具有亲水特性的固定相，流动相则以乙腈等有机溶剂为主，并含有一定比例的水或缓冲盐溶液。

主要应用

HILIC 色谱柱常用于分析在反相色谱中保留不足的极性化合物，例如：

 ●  糖类及部分糖相关化合物

 ●  氨基酸、亲水性肽段及其他极性代谢物

 ●  核苷、核苷酸及部分极性药物

 ●  其他在 C18 色谱柱上难以获得充分保留的极性物质

选型提示：当极性化合物在反相色谱柱上保留不足时，可考虑使用 HILIC 色谱柱。

6. 亲和色谱柱

亲和色谱利用固定相配基与目标分子之间的特异性相互作用进行分离。目标分子与配基结合后，其他未结合或结合较弱的组分可被洗脱，再通过调整pH、离子强度或加入竞争性配体等方式洗脱目标物。

常见应用

●  抗体及重组蛋白分离纯化

●  酶、受体等特定生物分子的分离

●  生物制药工艺开发及相关分析

选型注意事项

亲和色谱柱的效果取决于配基与目标分子的结合特性，以及结合和洗脱条件。选择时应确认配基的特异性，并评估目标物的稳定性与回收率。

7. 手性HPLC色谱柱

手性HPLC色谱柱用于分离对映异构体。其固定相含有手性选择剂，能够与不同对映异构体产生不同的相互作用，从而形成保留差异。

常见手性选择剂：多糖衍生物、环糊精及其他手性材料。

常见应用

●  对映体纯度测定

●  手性药物研发与质量控制

●  手性分析方法开发及制备分离

选型注意事项

手性分离效果与手性选择剂、流动相组成、温度及目标化合物结构有关。通常需要通过方法筛选，确认适合的固定相和分析条件。

如何选择合适的HPLC色谱柱？

选择色谱柱时，应先明确分析物性质和分离目标，再确定分离模式、固定相及规格。

其他需要关注的色谱柱参数

●  柱长：较长的色谱柱通常有利于提高分离能力，但也可能增加背压和分析时间。

●  内径：影响样品容量、溶剂消耗及仪器兼容性。

●  粒径：较小粒径通常有利于提高柱效，但会增加系统背压。

●  孔径：应与目标分析物的尺寸相匹配，尤其是在多肽、蛋白质和聚合物分析中。

●  pH与温度：应遵守色谱柱制造商规定的使用范围。

对于许多小分子分析方法，反相C18柱是实用的起始选择。如果分离度或选择性不足，可以评估C8、苯基、PFP、极性嵌入相等其他固定相；对于高极性、带电或具有手性特征的分析物，则应根据样品性质考虑其他分离模式。

结论

HPLC色谱柱应根据分析物性质、分离机制和实验目标进行选择。反相色谱柱广泛用于常规小分子分析，而正相、离子交换、体积排阻、亲和及手性色谱柱，则可满足不同的专门分离需求。

合适的色谱柱不仅取决于固定相类型，还需要综合考虑柱规格、孔径结构、流动相及操作条件。 结合实际样品进行方法筛选，才能确认色谱柱是否满足目标分离要求。

常见问题解答

1. 哪种HPLC色谱柱使用最广泛？

反相HPLC色谱柱，尤其是C18色谱柱，是许多小分子化合物分析方法的常用选择。其应用范围较广，但具体是否适用，仍需要结合分析物性质和分离要求判断。

2. C18和C8色谱柱有什么区别？

C18和C8的主要区别在于键合烷基链的长度。C18通常具有更强的疏水性，但实际保留差异还会受到固定相结构、键合密度、封端方式和流动相条件等因素影响。C8可作为某些保留过强或需要不同选择性时的备选方案。

3. 什么时候应该使用离子交换色谱柱？

当分析物在选定的流动相条件下带电，且分离主要依赖电荷差异时，可以考虑离子交换色谱。典型应用包括蛋白质电荷变体分析、氨基酸及部分无机离子的分离。

4. 填料粒径和色谱柱长度会影响分离效果吗？

会。较小的填料颗粒通常有助于提高柱效，但会增加背压；较长的色谱柱可以提供更高的柱效，但也可能延长分析时间并增加压力。 最终分离效果还与固定相选择性、保留和峰展宽等因素有关。

5. 一根HPLC色谱柱能分离所有类型的化合物吗？

不能。不同化合物的极性、电荷、分子尺寸和空间构型存在差异，单一固定相难以满足所有分离需求。应根据样品特点选择合适的分离模式，必要时通过色谱柱筛选和方法优化获得理想的分离结果。